Technische Universität München (TUM) Department of Chemistry Lehrstuhl für Biophysikalische Chemie

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Prof. Kiefhaber ist  seit April 2015 an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg tätig.

 

 

Email: t.kiefhaber@tum.de
Web: dante.phys.chemie.tu-muenchen.de/

Research themes

 

Project A8

 

Conformational dynamics in peptides and small proteins

Structural dynamics are essential for the function of most proteins. In this project we want to use triplet-triplet energy transfer (TTET) to study the folding/unfolding dynamics of a-helical und ß-hairpin peptides as well as the dynamics in the native state of small proteins in the time range of nanoseconds to microseconds. TTET coupled to a conformational equilibrium allows to characterize the dynamics of conformational equilibrium fluctuations and can distinguish different folded states based on their different dynamic properties. Donor and acceptor groups will be introduced at specific sites in various proteins and peptides to test for local and global unfolding reactions.

Konformationelle Dynamik in Peptiden und kleinen Proteinen

 

Untersucht werden soll die Dynamik von Proteinen im Zeitbereich von Nanosekunden bis Mikrosekunden mit Hilfe von Triplett-Triplett Energietransfer (TTET). Dabei wird TTET zwischen einem Triplett Donor und einem Triplett Akzeptor, die an spezifischen Stellen in Proteine eingeführt werden, beobachtet. Hierdurch gelingt es konformationelle Gleichgewichtsfluktuationen in Intermediaten und nativen Zuständen der Peptide zeitaufgelöst zu messen. Die Methode ist sensitiv für lokale und globale Bewegungen und kann verschiedene Zustände auf Grund ihrer unterschiedlichen dynamischen Eigenschaften unterscheiden. Zum Einen sollen die bereits erfolgreich durchgeführten Arbeiten zur Dynamik von a-Helices und der Villin Headpiece Domäne (HP35) weitergeführt werden. Es soll dabei die Dynamik von Helices verschiedener Länge untersucht werden, sowie gezielt stabilisierende bzw. destabiliserende Wechselwirkungen in Helices eingebaut werden und der resultierende Effekt auf die Dynamik der Helixbildung und –entfaltung gemessen werden. Die Ergebnisse sollen mit den Vorhersagen theoretischer Modelle für den Helix-Coil Übergang verglichen werden. In parallelen Arbeiten soll die Dynamik in ß-Haarnadeln untersucht werden, die bisher nur wenig verstanden ist. Dabei sollen die Haarnadelstrukturen des Proteins G (GB1) und der Foldon Domäne, die beide isoliert stabil sind, mit TTET Sonden markiert werden.
Im HP35 Protein haben wir im nativen Zustand ein Gleichgewicht zwischen einer starren und einer flexiblen Struktur beobachtet. Diese Zustände unterscheiden sich strukturell nur sehr wenig, haben aber sehr unterschiedliches dynamisches Verhalten. Die flexible Struktur ist vermutlich für die Funktion des Proteins wichtig und hat Eigenschaften eines „Dry Molten Globule“ (DMG) Zustands, der von unserer Arbeitsgruppe schon früher in zeitaufgelösten NMR Messungen an RNase A beobachtet wurde. In weiterführenden Versuchen wollen wir die dynamischen und strukturellen Eigenschaften des Gleichgewichts zwischen den beiden gefalteten Zuständen in HP35 besser charakterisieren. Unter Anderem sollen dabei TTET Messungen bei hohen Drücken durchgeführt werden, um die Reaktions- bzw. Aktivierungsvolumina zu bestimmen und damit das Modell eines DMG Zustands zu überprüfen. Zudem soll in anderen Proteinen nach DMG Zuständen mit Hilfe von TTET Messungen gesucht werden. Ziel ist es, TTET Sonden in das Protein NTL9 einzuführen, das im Gegensatz zum helikalen HP35 aus a-Helices und ß-Faltblättern besteht. In einem weiteren Ansatz sollen TTET Sonden mit nicht natürlichen Aminosäuren während der in vivo Proteinsynthese in größere Modellproteine eingebaut werden, um dort die dynamischen Eigenschaften des nativen Zustands mit funktionellen Eigenschaften, wie z.B. Enzymaktivität oder Bindung zu korrelieren. Diese Messungen sollen mit Ergebnissen von Einzelmolekül-FRET Messungen an den gleichen Proteinen verglichen werden.